广州动物园

一种虎全血DNA抽提的新方法

发布时间:2009-02-25

一种虎全血DNA抽提的新方法

《野生动物》杂志2007年第一期


黄志宏 黎绘宏1 王兴金1 李婉萍1 宾艳芳2
(1.广州动物园,广州,510070  2.华南农业大学,广州,510642)

摘要:以肝素钠抗凝的8只东北虎全血为材料,用CTAB自配细胞裂解液和细胞沉淀液,采用改进的方

法提取基因组DNA。结果表明,提取的基因组DNA纯度高,用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA,

带清晰、无拖尾现象。

关键词:东北虎;DAN抽提;全血;CTAB

中图分类号:S852                文献标示:A               文章编号

 

A New Method of Genome DNA Extraction of Tiger from Whole Blood

 

Wang Zhihong1, Li Huihong1, Wang Xingjin1, Li Wanping, 1 Bin Yanfang2

(1 Guangzhou Zoological Garden, Guangzhou 510070)

(2South China Agricultural University 510642)

 

Abstract: The genome DNA of Siberian tigers were extracted from whole blood by using an improved method. CTAB is as the major ingredient in cell lysis solution and precipitation solution. The results showed that the purity of genome DNA was high, and detected by agarose gel electrophoresis, the major bands of genome DNA were clear and without the smear phenomenon.

Key words: Siberian tiger; DNA Extraction; Whole Blood; CTAB

 

虎是亚洲特有的大型猫科动物,虎现在分了有八个亚种,其中不幸的是有三个亚种绝灭了,在我国的主要有东北虎和华南虎,而华南虎被列为世界濒危物种,截至到2005年底,只有68只,为了更好的研究华南虎,并能很好的保存华南虎的基因资源,能够从有限的血液中快速高效地抽提完整组织DAN就迫在眉睫,笔者尝试了多种血液提取DNA的方法,但是可以在虎血液中获得好的效果的不多,本文介绍一种快速,无需苯酚的快速抽提方法。

1  材料和方法

1.1  虎血液的采集和保存

试验虎是饲养于动物园的东北虎,麻醉用陆眠宁按照3ml/100kg进行肌注,采用陆醒灵复苏,剂量为陆眠宁的11.5倍,以1/2肌注,1/2静注。血液用1‰肝素钠抗凝,而后4℃保存。

1.2  主要试剂的购买和配置

该方法主要配置两种试剂,就是细胞裂解液和细胞沉淀液,CTABProteinase KRNase AdNTPTaq DNA聚合酶以及相应缓冲液都购自上海生物工程有限公司。引物设计参考哺乳动物猪的,该引物在其它动物也曾经得到好的特异性PCR产物,序列为,上游:5′GCGCTGCTTGTGTGTGTCCA3,下游:3GGGGCAGGTAACAGGATGGG5

1.2.1  细胞裂解液Cell Lysis Solution的配制方法

1M Tris 溶液的配置

Tris242.2g,加ddH2O1600ml,加热溶解。

1M TrisHCl Ph=8.0溶液的配置

1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0(需浓盐酸约8.5ml),加ddH2O定容至200ml,高压灭菌备用。

0.5M EDTA溶液的配置

EDTANa2 37.2g先用140ml ddH2O溶解,加入14ml NaOH10M)使EDTANa2溶解,再用NaOH10M)溶液调至Ph=8.0,加ddH2O定容至200ml,高压灭菌备用。

细胞裂解液的配制

15g十六烷基三乙基溴化铵(Hexadecyltrimethyl ammonium bromide, CTAB)(先用约600ml ddH2O加热溶解)放入烧杯中,加入75ml 1M TrisHClPh=8.0),58.5g NaCl(先用少量ddH2O溶解),30ml 0.5M EDTA,定容至1000ml,混合均匀备用。

1.2.2  沉淀液Precipitation Solution的配置方法

10gCTAB(先用约600ml ddH2O加热溶解),50ml 1M TrisHClPh=8.0),20ml 0.5M EDTA,定容至1000ml备用。

1.3  基因组DNA的提取

1.3.1  抽提操作过程:

取已经保存在4℃冰箱中的虎血液200μl,与200μl细胞裂解液(Cell Lysis Solution)混匀,加入1.5μl Proteinase K,置于55℃水浴锅中水浴1小时,中间要拿出摇匀几次。

从水浴锅中取出后,加入300μl氯仿,混匀,不能太剧烈,摇动1015分钟,以保证DNA的完整性。

用台式离心机10000rpm离心2分钟,此时应分为三层,基因组DNA在上层中,取约200μl的上清液,置于1.5ml离心管中。

加入250μl 沉淀液(Precipitation Solution)后,混匀,室温放置2分钟。10000rpm离心2分钟。

吸掉上清液,立即加入50μl 1.2M NaCl,轻轻振荡直至DNA样品完全溶解。加入1.5μl RNase A,然后置于55℃水浴锅中水浴510分钟。

加入150μl冷乙醇,-20℃放置10分钟。10000rpm高速离心34分钟。吸掉乙醇,后加入300μl 75%乙醇。吸掉乙醇,10000rpm离心2分钟。用风筒吹干后,加入50μl TE溶解。4℃冰箱过夜,或在37℃水浴锅中水浴备用。

1.3.2  PCR反应体系和程序

PCR的反应体系(总体积25μl)为:100ng的基因组DNA5pM浓度的引物1.2μlPCR Buffer反应缓冲液2.5μlMgCl2溶液1.5μl1UTaq聚合酶,其余用双蒸水补足。具体PCR的程序如下:94℃预变性4min31循环(94℃变性1min58℃退火1min70℃延伸1min),然后72℃延伸8min,最后4℃保存。本研究从8个虎DNA样本中随机拿出4个样本进行PCR,检测DNA的品质。

1.3.3  电泳检测

0.8%的含EB琼脂糖凝胶电泳检测,按照5v/cm进行电泳,大概10分种后,把电泳后的胶拿到凝胶成像系统进行成像,PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2  结果

从下图1中可以看到8个血液样品中都抽提到了高质量的虎DNA基因组,没有拖带现象,说明DNA双螺旋链完整,无降解,断裂现象。图2PCR产物电泳图,所扩增出来的产物片断大小为276bp,扩增结果与预期片段相符,说明所提取的基因组完全达到要求,DNA中没有抑制PCR反应的物质存在,可以用分子遗传学及相关研究。

3  讨论

3.1  DNA抽提的方法很多,如邵碧英等(2005)、吴信生等(2005)和张志等(2005)报道中用到异硫氰酸胍酚、苯酚、异戊醇和2-巯基乙醇等有刺激性气味或对人体有害的试剂,而本方法中用到的CTAB是完全无毒、无气味,价格很低廉,而且配置方法简单

3.2  哺乳动物红细胞没有细胞核,DNA主要存在于白细胞中,而白细胞在血液中所占的比例小,是否能够有效利用白细胞就是提取哺乳动物DNA的关键。本实验在借鉴家禽,家畜基因组DNA的提取方法的同时,进行了一些改进,尤其细胞裂解液的配方,CTAB原来是用在植物细胞壁破裂,经常用在植物的DNA提取,但在哺乳动物的DNA提取很少见相关报道,本方法尝试使用,发现它也可以有效的破裂白细胞,提高DNA提取的量。细胞裂解后,先用氯仿进行抽提,将大部分蛋白质抽提掉,而后加入的RNase A可以有效去处RNA的污染,再按常规方法进行DNA提取,从而保证了所提取基因组DNA的纯度,相应地保证了用于分子遗传学实验所需要的基因组。

3.3  快速、经济、安全、高效地从动物血液或组织标本中提取高产量、高纯度的基因组DNA,对于基因诊断和所有的分子生物学试验都是至关重要的。目前基因组DNA提取方法有传统蛋白酶K消化法[1]、非有机溶剂提取法[2]和固相吸附法[3]等。本文建立的DNA提取方法不需要昂贵的试剂,所花时间较少,抽提24个样本,一个人操作,除去消化的时间,只需要45分种左右,并且用微量的血,200μl就可以得到足量的DNA,在野生动物研究中血液来源困难的情况下,该方法更加适合于野生动物快速抽提DNA。本方法现在在猪、鸡、鱼等动物的血液和组织中试用,也得到了很好的效果,因此具有很好的适用性和推广价值。

 

参考文献

[1]         .萨姆布鲁克,E..弗里奇,T.曼尼阿蒂斯著,金冬雁译. 分子克隆实验指南. 第二版. 北京:科学出版社,1992304.

[2]         Rudeck L, Dissing J. Rapid, simple alkaline extraction of human genomic DNA from whole blood, buccal epithelial cells, semen and forensic stains for PCR. Biotechniques, 1998,25(4):588~592.

[3]         Tian H, Huhmer AFR, Landers JP. Evaluation of silica resins for direct and efficient extraction of DNA from complex biological Matrices in miniaturized format. Anal Biothem,2000 ,283(3):175~191.

[4]         邵碧英,杨婕,张体. 银动物产品的DNA提取方法. 畜牧与兽医,2005374749.

[5]         吴信生,刘忠慧,赵辉玲等. 家兔全血基因组DNA提取方法. 中国养兔杂志,200561719.

[6]         张志,王龙武. 全血基因组DNA快速提取法. 湘南学院学报(自然科学版)200571214.

 

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